转录因子的巯基亚硝基化修饰及其生理学意义

摘    要：巯基亚硝基化(S-nitrosylation)修饰是一种一氧化氮(nitric oxide,NO)介导的氧化还原依赖的、可逆性蛋白质翻译后修饰。生理条件下,S-nitrosylation通过调控蛋白质的稳定性、蛋白质活性、亚细胞定位及蛋白质-蛋白质相互作用,在维持细胞稳态中发挥重要作用。而在多种病理条件下,蛋白质S-nitrosylation及其产物表现出异常的升高或降低。转录因子又称反式作用因子,通过识别并结合调控元件而影响基因转录。本文简要综述转录因子的S-nitrosylation修饰的研究进展及其生理学意义。

关键词:巯基亚硝基化修饰;转录因子; -氧化氮;基因表达;转录活性;

The Pathophysiological Role of S-nitrosylation of Transcription Factors

CUIQi DU Xiong XIAO Lei WANG Nan-Ping

Cardiovascular Research Center, School of Basic Medical Sciences,Xi'an Jiaotong University The

Advanced Institute for Medical Sciences Dalian Medical University

East China Normal University

Health Science Center

Abstract：Protein S-nitrosylation,the oxidative modification of cysteine by nitric oxide(NO) to form protein S-nitrosothiols(SNOs),mediates redox-based signaling.Physiologically,S-nitrosylation regulates protein stability,activity,subcellular localization,and protein-protein interactions and plays important roles in maintaining cell homeostasis.However,aberrant S-nitrosylation is associated with diverse pathobiologies.Transcription factors are key molecules that bind to DNA-regulatory sequences(enhancers and silencers),usually localized in the 5'-upstream region of target genes,to regulate gene expression.Here we review the biochemical mechanisms underlying the S-nitrosylation of transcription factors,and discuss the multiple roles of S-nitrosylation in the regulation of gene transcription.

Keyword：S-nitrosylation; transcription factor; nitric oxide; gene expression; transcriptional activity;

巯基亚硝基化（S-nitrosylation）修饰是指一氧化氮（nitric oxide,NO）与底物蛋白质半胱氨酸巯基（-SH）反应生成亚硝基化巯基（S-nitrosothiols,SNO）的一种蛋白质翻译后修饰。通过该修饰形成的SNO可调控蛋白质的结构、稳定性、亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用等，从而发挥NO除环磷酸鸟苷（cGMP）依赖的信号通路以外的生物活性。蛋白质S-nitrosylation是一种氧化还原依赖的可逆性修饰，由NO合酶（nitric oxide synthase,NOS）及去亚硝基化还原酶系统共同调控[1]。已知受到S-nitrosylation修饰的底物包括转录因子、酶、受体、信号转导分子等。转录因子是细胞内多种信号通路的关键调节因子，与靶基因启动子区域DNA结合来控制该基因的转录。本文简述巯基亚硝基化修饰对转录因子的调控作用、机制及其生理学意义。

一、NO与蛋白质巯基亚硝基化修饰

（一）NO的作用途径

NO是由NOS催化底物L-精氨酸生成的内源性单分子气体自由基，具有重要的信号传递功能。NO对细胞功能的调控的重要途径之一是结合可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）中血红素的亚铁离子，促进sGC将三磷酸鸟苷（GTP）转化为cGMP，激活cGMP依赖的蛋白激酶G(PKG），进而启动一系列磷酸化反应、级联放大信号，产生生物学功能。这一过程是cGMP依赖性信号通路途径，介导了NO在细胞内的大部分功能。此外，NO还发挥非cGMP依赖的调控作用：NO及其氮氧衍生物（OONO-、NO-、NO+、N2O3等）作用在蛋白质-SH，使蛋白质发生S-nitrosylation生成-SNO。

（二）蛋白质巯基亚硝基化与去亚硝基化

Snitrosylation是一种氧化还原依赖的可逆性修饰，包括亚硝基化和去亚硝基化过程（图1）。该修饰主要通过两种方式实现：一种是NO直接作用于蛋白质-SH，生成-SNO；另一种是转亚硝基化。细胞中常见的转亚硝基化-SNO供体有巯基亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione,GSNO）、巯基亚硝基半胱氨酸（S-nitrosocysteine,CSNO）等小分子化合物及已发生巯基亚硝基化的蛋白质（如磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH，可将亚硝基基团转移至其他蛋白质）[2]。

该修饰的去亚硝基化作用是指蛋白质半胱氨酸残基上的-SNO基团重新还原为-SH形式的过程。去亚硝基化的两大酶促反应系统包括GSNO还原酶（GSNOR）/谷胱甘肽还原酶（GR）系统、硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）/Trx还原酶（TrxR）系统[2]。GSNOR是乙醇脱氢酶家族成员之一，催化GSNO经由GR还原为谷胱甘肽（gluthathione,GSH）进而降低体内NO和亚硝基化水平；TrxR催化Trx由分子内二硫键（-S-S-）形式转换为-SH形式[3]。

二、巯基亚硝基化对转录因子的修饰及其功能调控

（一）NF-κB

核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）几乎存在于所有细胞类型中，是一种多效转录因子，参与调控炎症反应、细胞凋亡、粘附、分化和增殖等过程。在哺乳动物中NF-κB有5种不同的亚基：p50、p65 (RelA）、p52、c-Rel、RelB。NF-κB通常以同源/异源二聚体的形式存在，最常见的是p65与p50构成的异源二聚体。Matthews等首先在体外采用NO供体硝普钠（SNP）和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）处理重组的NF-κB p50及p65同源二聚体、p50-p65异源二聚体，研究了NF-κB的DNA结合活性。研究结果显示NO供体对NF-κB p50的62位半胱氨酸（Cys62）残基进行巯基亚硝基化修饰，抑制了其与DNA的结合能力[4]。随后，Marshall等在人肺癌细胞系A549中证实，NO供体CSNO诱导NF-κB的S-nitrosylation，抑制NF-κB的转录活性，使A549细胞对于TNFα诱导的细胞凋亡更敏感（Marshall等．2002）。Kelleher等发现，在人胚肾细胞HEK 293中，CSNO可诱导NF-κB p65发生S-nitrosylation(Cys38）。给予A549及小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞因子混合物（TNFα、IL-1β、LPS、interferon-γ等）处理后，亚硝基化的NF-κB p65水平也增高，且这一过程由iN-OS介导[5]。此外，在兴奋性神经递质谷氨酸的毒性作用下，eNOS使NF-κB p65亚基发生S-nitrosylation，抑制其活性，进而提高神经细胞存活率，起到神经保护作用[6]。

NO除了通过直接对NF-κB各亚基进行S-nitrosylation修饰进而调控其转录活性外，还能通过影响与NF-κB相互作用蛋白的亚硝基化间接调控其活性。静息状态，NF-κB与其抑制蛋白（IκBα）结合，定位在细胞浆中。一旦受到外界信号刺激，NF-κB抑制物激酶（IκB kinase,IKK）被活化，导致IκBα磷酸化及泛素化降解。失去IκBα抑制作用后，NF-κB入核，调控下游基因的转录表达。在肺上皮细胞及Jurkat T细胞中，无论是外源的NO还是TNFα的刺激均能诱导IKKβ的179位半胱氨酸（Cys179）发生亚硝基化修饰，降低IκB的磷酸化，阻止NF-κB的入核，抑制炎症反应（Reynaert等．2004）。此外，eNOS来源的NO还介导髓样分化因子88(MyD88）的Toll/白介素-1受体结构域（TIR）中特定半胱氨酸残基的亚硝基化修饰，抑制其向细胞膜的转位及其与TIR结构域适配蛋白（TI-RAP）、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6）的结合，从而抑制IκBα的磷酸化，抑制NF-κB的活化[7]。

（二）AP-1

激活蛋白-1(AP-1）通常是一类由c-Jun和c-Fos组成的二聚体。c-Jun蛋白可以形成同源二聚体，也可以与c-fos形成异源二聚体。但cfos蛋白无法形成同源二聚体，只能与c-Jun蛋白形成异源二聚体。c-Jun/c-fos形成的异源二聚体最为常见，也是AP-1的主要存在形式。AP-1含有三个重要的结构域：DNA结合结构域、转录激活结构域、以及亮氨酸拉链（二聚体间相互作用区域）。AP-1在生理状态下活性很低，在细胞内应激、辐射或感染等信号刺激下被激活后，与DNA序列结合，启动多种与细胞分裂、增殖相关的基因转录。

体外实验证实NO诱导位于DNA结合结构域的c-Jun的272位以及c-Fos的154位半胱氨酸残基发生亚硝基化修饰，抑制AP-1的DNA结合活性。且这种作用会被还原剂二硫苏糖醇（DTT）及去亚硝基化Trx系统逆转[8,9]。随后，Hammoud等研究发现eNOS来源的NO通过亚硝基化修饰cJun，抑制AP-1的活性及心肌细胞基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-3）的表达，促进心肌细胞增殖[10]。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导JNK1的第116位和第163位半胱氨酸发生S-nitrosylation激活AP-1促进心肌纤维化的发生[11]。

c-Jun的磷酸化是AP-1转录激活的主要方式。其中，JNK是主要负责c-Jun磷酸化的激酶。在巨噬细胞和小神经胶质细胞中，iNOS的激活促使JNK1在116位的半胱氨酸发生亚硝基化并抑制其酶活性，进而抑制JNK1和c-Jun的相互作用（Park等．2000）。过表达nNOS也会亚硝基化JNK1并抑制其活性（Park等．2006）。相反，在脑缺血再灌注损伤中，JNK3的亚硝基化水平增加，而抑制nNOS和iNOS则可削弱JNK3的亚硝基化，并降低其磷酸化的能力。这提示JNK3的亚硝化可能有助于维持其酶活性[12]。

（三）HIF-1α

缺氧诱导因子1α(HIF-1α）是体内维持氧稳态的重要转录因子，通过结合低氧反应基因的反应元件，调控多种涉及血管生成、凋亡、炎症、代谢和发育的基因表达（如VEGF、TGFβ），维持机体稳态。有研究显示NO供体NOC-18能够以不依赖于基因转录的方式上调HIF-1α的蛋白质水平及DNA结合活性。NOC-18的这种作用可被DTT逆转，提示巯基的修饰可能参与了HIF-1α蛋白稳定性及转录活性的调节（Palmer等．2000）。之后的研究表明，在HEK293细胞中GSNO或细胞因子（激活iNOS）促进HIF-1α的800位半胱氨酸的亚硝基化，增强其对转录共激活因子p300/CREB的招募，增加其转录活性[13]。此外，放疗激活巨噬细胞产生的NO诱导小鼠HIF-1α的533位半胱氨酸发生亚硝基化修饰，该修饰抑制了HIF-1α与E3泛素连接酶VHL的相互作用，进而阻止了HIF-1α的降解，增强了其蛋白稳定性（Park等．2008）。Lima等发现在冠状动脉左前支结扎术中，GSNOR-/-小鼠的心肌缺血面积减小、心肌毛细血管密度增加；而常氧状态下GSNOR-/-小鼠的心肌HIF-1α的亚硝基化增加，且转录活性及蛋白质稳定性也提高。这表明HIF-1α的亚硝基化可能通过促进血管新生保护了缺血性心肌免受损伤。这也是NO保护心血管功能的重要机制之一（Lima等．2009）。在急性贫血的小鼠大脑中nNOS促使VHL亚硝基化、HIF-1α蛋白增加，并改善存活率；但该研究也发现HIF-1α本身亚硝基化无明显改变，提示VHL的亚硝基化可能阻止HIF-1α的降解，维持其对细胞和组织的保护作用（Tsui等．2011）。最近，有研究发现小窝蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1）在缺氧诱导的条件下，通过降低HIF-1α的亚硝基化修饰水平和转录活性，抑制肿瘤生长[14]。

（四）Nrf2

Nrf2是调节抗氧化应激损伤的重要转录因子，通过调控抗氧化基因的表达保护机体免受氧化应激损伤。Nrf2的活性受到与其相互作用的蛋白的亚硝基化修饰的调控。在生理状况下，Nrf2作为应激传感蛋白存在于细胞浆内，与胞浆蛋白伴侣分子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1）结合。Keap1作为E3泛素连接酶复合物的接头蛋白，促使Nrf2蛋白发生泛素化降解。在受到应激刺激（如：氧化应激、炎症反应）时，Keap1会被活性氧物质修饰而失活，导致其与Nrf2发生解离，Nrf2转位入核，促进靶基因的表达。Han等发现NO促进Keap1的151位半胱氨酸发生亚硝基化，从而破坏Keap1与Nrf2的相互作用，促进Nrf2核转位[15]。亚硝基化修饰通过激活Nrf2，诱导靶基因的表达，进而抑制iNOS的表达，这种负反馈的机制可抑制NO的过度产生，从而维持炎症反应的平衡（Ashino等．2008）。Samuel等也发现，乳制品Kefir通过增加Nrf2的表达，促进链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾皮质中过氧化氢酶（catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（SOD-1）的表达，进而减少氮化应激的产生[16]。同时有研究发现，eNOS介导木犀草素诱导的Keap1的亚硝基化，进而上调Nrf2及其相关的抗氧化信号通路，保护糖尿病患者心脏免受缺血再灌注损伤（Xiao等．2019）。此外，NO还能亚硝基化修饰染色体区域稳定蛋白1(chromosomal region maintenance 1,CRM1)(528和585位半胱氨酸），减弱CRM1与核输出信号（nuclear export signal,NES）的相互作用，促进Nrf2在细胞核中的积累，同时促进Nrf2与启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）结合，进而激活Nrf2及其下游靶基因的表达[17]。

（五）KLF4

KLF4是Krüppel样因子家族成员之一，调控细胞增殖、凋亡、分化等。同时，作为血管稳态的重要调节因子，KLF4具有调节血管舒张、抗炎、抗氧化等血管保护作用。我们的前期研究表明：内皮细胞KLF4在氮化应激的刺激下，发生蛋白质巯基亚硝化修饰，进而抑制其核转位及转录活性。进一步通过质谱鉴定以及定点突变技术我们明确了KLF4的巯基亚硝化修饰发生在半胱氨酸437位。此外，在血管功能研究上，我们发现KLF4的亚硝基化修饰抑制了其对肺动脉血管的保护作用。肺动脉高压的危险因素之一内皮素-1(ET-1）增加KLF4的亚硝基化水平。相反，治疗肺高压的药物波生坦显著降低KLF4的亚硝基化水平。在缺氧诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中，KLF4巯基亚硝化水平显著升高，同时KLF4在细胞核中的分布减少。因此，巯基亚硝化修饰是KLF4的一种新的翻译后修饰机制。我们的研究也为肺动脉高压等血管疾病的发病机制及治疗提出新的策略[18]。

（六）p53

P53负责调控细胞周期、DNA修复、凋亡等过程。NO一方面通过诱导DNA链断裂激活p53，另一方面通过对p53的翻译后修饰实现对其活性的调控。在人黑色素瘤A375细胞系中，p53的DNA结合域中277位半胱氨酸可发生亚硝基化修饰，抑制其与靶基因p21和鼠双微体基因2(MDM2）的结合及转录[19]。p53的亚硝基化还是维持骨骼肌氧化还原稳态的重要机制。在小鼠C2C12成肌细胞中，p53DNA结合区的124位半胱氨酸的亚硝基化会增强其对靶基因超氧化物歧化酶（SOD-2）和GCL催化亚基（GCL catalytic subunit,GCLC）的表达调控，进而抑制氧化应激[20]。

另外，亚硝基化修饰也会间接调控p53的转录活性。NO通过亚硝基化修饰MDM2间接调控p53。MDM2是p53的一个转录靶点，正常情况下MDM2与p53结合，抑制p53转录活性（Schonhoff等．2002）。MDM2也可以作为E3连接酶使p53发生泛素化降解（Fang等．2001）。亚硝基化抑制了MDM2与p53的相互作用，阻止了p53的核转位，使得核中p53增多、转录活性增强。S100钙结合蛋白B(S100B）也是已知的p53的结合蛋白和调节因子，NO可通过促进S100B的亚硝基化，增加p53的转录活性（Dieck等．2009）。在帕金森症小鼠模型中，p53的抑制子Parkin的亚硝基化增加使其活性降低，引起p53的蛋白表达增加（Sunico等．2013）。此外，NO还能通过增加p38 MAPK的15位丝氨酸的磷酸化，增强p53的活性[21]。

（七）MEF2

肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2）属于转录调节因子MADS-Box家族，广泛表达在心肌、骨骼肌和平滑肌，通过控制肌细胞分化过程中的基因转录参与肌肉形成、骨骼发育、神经系统发育、肝脏纤维化等。有A、B、C、D四种亚型。在帕金森症模型中，神经元MEF2C的亚硝基化水平增加，破坏了MEF2C的DNA结合能力，抑制靶基因过氧化物酶体增殖物激活受体共激活子（peroxisome proliferator-activated receptor-gammacoactivator,PGC1α）的表达，导致线粒体功能异常和细胞凋亡（Ryan等．2013）。Okamoto等发现MEF2的39位半胱氨酸可发生亚硝基化[22]。在阿尔茨海默症中，MEF2C的亚硝基化抑制其靶基因凋亡抑制基因Bcl-xL(B-Cell Lymphoma-extra-large）的表达，导致大脑神经元的死亡；同时，MEF2A的亚硝基化水平也增加，抑制其靶基因TLX蛋白的表达，破坏大脑皮质神经元的再生[23]。

（八）ERα

雌激素受体（estrogen receptor,ER）是核受体超家族（nucleus receptor,NR）成员之一。作为一种激素受体，ER能够被其配体雌激素中的主要成分17β-雌二醇激活，参与细胞增殖、分化、凋亡等各种重要的生理调控过程。ER可以分成ERα和ERβ两个亚型，它们都包含核受体经典的结构域：转录激活域、配体结合区、铰链区和DNA结合区。Marino等早期研究发现：在HeLa细胞中，NO能够抑制17β-雌二醇诱导的ERα靶基因的表达。相反，代表ERα的非基因组效应的DNA合成和IP3的产生则不受NO影响。这提示NO对配体依赖的ERα基因组或非基因组的选择性作用，可能与NO介导的ERαDNA结合区中富含的半胱氨酸残基的化学修饰削弱了ERα的DNA结合能力有关（Marino等．2001）。随后，Garban等证实，NO供体无论是与ERα的纯化蛋白反应，或直接作用于人乳腺癌细胞MCF-7，均增加ERα的亚硝基化水平。且NO抑制ERα与特异性雌激素反应元件的结合[24]。同样，在人脐静脉内皮细胞中，17β-雌二醇上调eNOS的表达，促使ERα亚硝基化水平增加（Zhang等．2010）。暴露于香烟烟雾提取物24小时后，人支气管平滑肌细胞中ERα的亚硝基化水平增加，香烟烟雾干扰了雌激素对支气管扩张的正常保护性作用，这可能是由于亚硝基化修饰降低了ERα的转录活性所致[25]。

（九）AR

雄激素受体（androgen receptor,AR）属于NR超家族中的类固醇受体，主要表达于肝脏、卵巢、前列腺、子宫内膜和脂肪等。当AR与雄激素配体如5α-二氢睾（5α-dihydrotestosterone,DHT）结合后，转位到细胞核，形成异源二聚体刺激靶基因的转录，调节与葡萄糖和脂质相关的通路及细胞的增殖和分化。Cronauer等[26]研究发现NO供体抑制AR报告基因活性及DNA结合能力，但不影响AR的蛋白水平和核转位。随后有研究发现，细胞内NO水平的增加促使AR的DNA结合结构域中601位半胱氨酸发生亚硝基化，并抑制AR阳性的雄激素依赖性前列腺肿瘤的生长。在没有雄激素刺激的情况下，AR被热休克蛋白HSP90阻滞在细胞质中，同时HSP90上的SNO基团被转移到AR上，发生转亚硝基化修饰，抑制AR活性及前列腺肿瘤的生长（Qin等．2013）。也有报道称，前列腺肿瘤中iNOS表达增多，iNOS释放的NO可能通过亚硝基化修饰AR，抑制其活性，进而促进雄激素非依赖性前列腺癌的发生发展[27]。因此，将iNOS和NO作为卵巢和前列腺肿瘤治疗的新靶点，为疾病的治疗提供了新的手段。

（十）PPARγ

PPARγ是过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）的亚型之一，是调节糖脂代谢的重要转录因子。Kuncewicz等人用肾小球系膜细胞核提取物与NO共同孵育后进行质谱检测，结果显示PPARγ能发生亚硝基化修饰。采用IL-1β刺激系膜细胞后生物素转化法也显示PPARγ的亚硝基化水平增加（Kuncewicz等．2003）。在iNOS-/-肥胖小鼠的脂肪组织中PPARγ的转录活性增强且罗格列酮改善葡萄糖耐受的作用也增强，提示iNOS可能通过介导PPARγ的亚硝基化修饰进而抑制其功能。在人正常肝细胞L02中，GSNO增加PPARγ的亚硝基化水平并伴随PPARγ蛋白表达的减少[28]。在GSNOR-/-小鼠分离的骨髓间充质干细胞中，PPARγ的亚硝基化水平增加，其与靶基因脂肪酸结合蛋白4(FABP4）的结合能力减弱。进一步研究显示PPARγ的139位半胱氨酸发生亚硝基化降低其转录活性[29]。我们的前期研究发现在共培养体系中，iNOS/NO介导了促炎激活的巨噬细胞诱导的脂肪细胞的PPARγ亚硝基化修饰。我们利用生物素标记结合质谱分析、定点突变等方法证实了PPARγ的亚硝基化修饰发生在168位半胱氨酸残基抑制了其转录活性及蛋白稳定性。我们的研究提示脂肪组织中的促炎巨噬细胞通过亚硝基化抑制PPARγ的活性和功能，损害机体的胰岛素敏感性。这可能是代谢性炎症诱发组织胰岛素抵抗的一个新的机制[30]。

表1总结了已报道的转录因子发生巯基亚硝基化修饰位点、所在功能结构域以及巯基亚硝基化修饰对其转录活性及功能的主要影响。

三、结语和展望

转录因子在真核生物转录起始中具有重要作用，对于基因表达的调控至关重要。转录因子广泛参与调控生物体内各种病理生理过程，其详细的调控作用机制仍值得进一步研究和探讨。越来越多的证据已经表明：转录因子的巯基亚硝基化修饰是其发挥基因调控功能的重要方式之一。此外，一些与转录调控密切相关的转录辅助蛋白（如PARP1、hnRNA A/B、Ref-1）、表观遗传相关蛋白（HDAC2、SIRT1）、核转运相关蛋白（importin-β、Ran）等也会发生亚硝基化修饰，从而改变其功能。这些以转录因子的巯基亚硝基化修饰为靶点的干预手段，为疾病的临床治疗提供了新的思路。

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