应用酶联抗体检测系统性红斑狼疮患者血清抗体的有效性分析

　　摘    要：目的 探讨应用酶联抗体检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血清抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗核小体抗体(AnuA)、抗史密斯(Sm)抗体及抗磷脂抗体的效能及评估患者疾病活动度的价值。方法 选取该院收治的88例SLE患者(SLE组)及88例体检健康者(对照组),应用酶联抗体检测两组血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、抗β2糖蛋白1(β2GP1)抗体、抗心磷脂抗体(ACA)水平，比较SLE疾病不同活动度患者各血清抗体水平，采用Pearson相关分析各血清抗体与系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)的相关性，绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析各血清抗体诊断SLE及不同疾病活动度的效能。结果 SLE组抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平均高于对照组(P<0.05);ROC曲线分析结果显示，抗Sm抗体诊断SLE的曲线下面积(AUC)最大，为0.839;AnuA评估SLE轻、中度活动的AUC最大；抗dsDNA抗体评估SLE重度活动的AUC最大；相关性分析显示，抗dsDNA抗体、AnuA、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA均与SLEDAI评分呈正相关(P<0.05)。结论 SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体及抗磷脂抗体水平明显升高，且血清抗dsDNA抗体、AnuA及抗磷脂抗体与SLEDAI评分呈正相关，应用酶联抗体检测SLE患者各项血清抗体对SLE的诊断、疾病活动度评估具有重要意义。

　　关键词：系统性红斑狼疮 抗双链DNA抗体 抗磷脂抗体 疾病活动度

　　Efficacy analysis of using enzyme-linked antibody to detect serum antibodies in patients with systemic lupus erythematosus

　　LAI Lichuan WU Rongcai MENG Danli WANG Bangqin

　　Department of Clinical Laboratory,the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region; Department of Rheumatology,the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region;

　　Abstract：Objective To investigate the efficacy of using enzyme-linked antibodies to detect serum anti-double-stranded DNA(dsDNA) antibody, anti-nucleosome antibody(AnuA),anti-Smith(Sm) antibody and anti-phospholipid antibody in patients with systemic lupus erythematosus(SLE) and the value of evaluating the patient′s disease activity.Methods A total of 88 SLE patients(SLE group) and 88 healthy subjects(control group) were selected from the hospital.Enzyme-linked antibody were used to detect serum anti-dsDNA antibody, AnuA,anti-Sm antibody, anti-β2 glycoprotein 1(β2 GP1) antibody, and anti-cardiolipin antibody(ACA) in the two groups.The serum antibody levels of patients with different activities of SLE were compared, the correlation between each serum antibody and SLEDAI score were analyzed by Pearson correlation, and the efficiency of diagnosing SLE and different disease activities were analyzed by drawing ROC curve.Results The levels of anti-dsDNA antibody, AnuA,anti-Sm antibody, IgG-β2 GP1,IgM-β2 GP1,IGg-ACA and IgM-ACA in SLE group were higher than those in control group(P<0.05).The area under curve(AUC) of anti-Sm antibody in SLE diagnosis was the highest at 0.839,the AUC of AnuA in the evaluation of mild and moderate activity of SLE patients was the largest, and the AUC of severe activity of SLE patients evaluated by anti-dsDNA antibody was the largest.Anti-dsDNA antibody, AnuA,IgG-β2 GP1,IgM-β2 GP1,IgG-ACA,IgM-ACA were positively correlated with SLEDAI score(P<0.05).Conclusion The serum levels of anti-dsDNA antibody, AnuA,anti-Sm antibody, and anti-phospholipid antibody in SLE patients were significantly increased, and the levels of anti-dsDNA antibody, AnuA and anti-phospholipid antibody were positively correlated with SLEDAI score, which are of great value for the diagnosis of SLE and the evaluation of disease activity.

　　Keyword：systemic lupus erythematosus; anti-double-stranded DNA; anti-phospholipid antibody; disease activity;

　　我国系统性红斑狼疮(SLE)发病率约为70/10万，20～40岁育龄期女性是其高发人群[1-4]。SLE的发病机制较为复杂，大量研究证实，SLE患者体内存在多种自身抗体，故自身抗体检测已逐渐成为诊断SLE及评估肾功能损害的参考项目之一[5-7]。其中抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗史密斯(Sm)抗体已被证实可用于SLE的诊断。而抗核小体抗体(AnuA)与核小体可形成免疫复合物，参与机体免疫炎性反应，同时，抗磷脂抗体可刺激机体免疫系统，但关于酶联抗体检测上述血清抗体对SLE疾病活动度的评估价值研究较少。基于此，本研究应用酶联抗体检测SLE多个血清抗体，并量化分析各抗体诊断SLE及评估疾病活动度的价值，现报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　选取2018年1月至2020年3月本院收治的88例SLE患者(SLE组)及88例体检健康者(对照组)为研究对象。根据系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)评分将SLE组分为轻度活动组(46例)、中度活动组(27例)、重度活动组(15例),轻度活动为临床稳定，无明显内脏损害，SLEDAI评分<10分；中度活动为SLE明显累及重要脏器且需治疗，SLEDAI评分为10～14分；重度活动为SLE累及重要脏器，SLEDAI评分≥15分。SLE组男43例，女45例，平均年龄(43.66±12.15)岁，平均体质量指数(BMI)为(23.49±2.25)kg/m2;对照组男40例，女48例，平均年龄(45.09±11.86)岁，平均BMI为(23.61±2.14)kg/m2。两组间年龄、性别、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入标准：(1)SLE组均符合SLE诊断标准[8],满足以下11项中4项或4项以上即可确诊，包括颊部红斑、盘状红斑、光过敏、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎、肾脏病变、神经病变、血液学疾病、免疫学异常、抗核抗体阳性；(2)对照组无自身免疫性疾病、血栓事件等。排除标准：(1)急慢性感染者；(2)处于妊娠期、产褥期或哺乳期等特殊时期的女性；(3)合并类风湿关节炎或其他风湿性疾病者；(4)合并肝、肾等重要脏器器质性病变者；(5)伴有再生障碍性贫血、白血病或其他血液系统疾病者；(6)近14 d内服用过激素、免疫抑制剂等影响检测结果的药物；(7)合并严重听力障碍、失语或精神行为异常者。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

　　1.2 方法

　　两组研究对象入院后24 h内于清晨8:00空腹抽取静脉血5 mL,1 000×g离心20 min(离心半径10 cm),分离取血清，置于-20 ℃低温保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、抗β2糖蛋白1(β2GP1)抗体、抗心磷脂抗体(ACA),严格参照南京赛泓瑞生物科技有限公司提供的试剂盒说明书操作，具体过程如下。(1)准备工作：将所需试剂及标本均平衡放置在20～26 ℃室温下，充分混匀，以1∶40对辣根过氧化物酶(HRP)清洗浓缩液进行稀释，并设置复孔。(2)标本检测：将预先稀释的抗dsDNA抗体(1 mL)、AnuA(1 mL)、抗Sm抗体(1 mL)及抗磷脂抗体ELISA低值阳性对照、高值阳性对照、阴性对照及稀释后血清标本分别置入微孔板，室温条件下孵育30 min。弃去孔内液体，并于各孔内加入稀释后洗涤液(300 μL),吸除液体。重复上述清洗步骤2次后，于各孔内均加入HRP IgG酶结合物(100 μL),室温条件下孵育30 min, 重复上述清洗步骤。各孔内均加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物液(100 μL),室温条件下避光孵育30 min。最后各孔内均加入HRP终止液(100 μL),终止反应后60 min内于450 nm处读取各孔吸光度值。

　　1.3 观察指标

　　(1)比较两组血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(2)分析血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA对SLE的诊断效能。(3)比较SLE组不同疾病活动度患者血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平。(4)分析血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平与SLEDAI评分的相关性。(5)分析血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA评估SLE疾病活动度的效能。

　　1.4 统计学处理

　　采用 SPSS22.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关；采用受试者工作特征(ROC)曲线进行诊断效能评价，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 两组血清抗体水平比较

　　SLE组抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.2 各血清抗体诊断SLE的效能

　　ROC曲线分析显示，抗Sm 抗体、IgG-β2GP1、AnuA、IgG-ACA、抗dsDNA 抗体、IgM-ACA、IgM-β2GP1诊断SLE 的曲线下面积(AUC)分别为0.839、0.837、0.831、0.811、0.809、0.761、0.741,特异度分别为87.50%、90.91%、90.91%、94.32%、90.91%、90.91%、93.18%。见图1。

　　表1 两组血清抗体水平比较(x¯±s)

　　图1 各血清抗体诊断SLE的ROC曲线

　　2.3SLE组不同疾病活动度患者血清抗体水平比较

　　抗dsDNA抗体、AnuA、IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平比较，重度活动组高于中度、轻度活动组，中度活动组高于轻度活动组(P<0.05);抗Sm抗体在不同疾病活动度患者间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

　　2.4 各血清抗体与SLEDAI评分的相关性

　　Pearson相关分析显示，抗dsDNA抗体(r=0.782)、AnuA(r=0.752)、IgG-β2GP1(r=0.913)、IgM-β2GP1(r=0.938)、IgG-ACA(r=0.940)、IgM-ACA(r=0.975)均与SLEDAI评分呈正相关(P<0.05)。

　　2.5 各血清抗体评估SLE疾病活动度的效能

　　ROC曲线分析显示，抗dsDNA抗体评估轻、中度活动的AUC为0.780,重度活动的AUC为0.819;AnuA评估轻、中度活动的AUC为0.791,重度活动的AUC为0.801;IgG-β2GP1评估轻、中度活动的AUC为0.744,重度活动的AUC为0.792;IgM-β2GP1评估轻、中度活动的AUC为0.708,重度活动的AUC为0.750;IgG-ACA评估轻、中度活动的AUC为0.771,重度活动的AUC为0.792;IgM-ACA评估轻、中度活动的AUC为0.783,重度活动的AUC为0.815。见图2、3。

　　图2 各血清抗体评估轻、中度活动的ROC曲线

　　表2 SLE组疾病不同活动度患者各血清抗体水平比较(x¯±s)

　　表2 SLE组疾病不同活动度患者各血清抗体水平比较(x¯±s)

　　图3 各血清抗体评估重度活动的ROC曲线

　　3 讨 论

　　SLE的发病机制迄今尚未完全阐明，研究显示，SLE的发病过程中往往伴有T细胞参与和B细胞活化，一定程度上会侵犯多个器官与组织，产生多种免疫复合物，引起机体免疫调节紊乱，导致局部或全身性损伤[9-10]。同时，SLE患者外周血凋亡淋巴细胞会过度释放自身抗原，产生一系列自身抗体[11-12]。因此，早期检测自身抗体水平对辅助诊治SLE具有积极作用。

　　抗Sm抗体是公认的SLE标记性抗体，在临床应用较为广泛。本研究经ROC曲线分析发现，抗Sm抗体诊断SLE的效能优于抗dsDNA抗体、AnuA及抗磷脂抗体，特异度可达87.50%,与张树君[13]研究结果一致。但SLE患者中抗Sm抗体阳性者仅约30%,故抗Sm抗体阴性时无法排除SLE诊断，且单纯检测抗Sm抗体具有一定局限性，灵敏度较低[14-15]。同时，本研究结果显示抗Sm抗体与SLE患者疾病活动度无关，与张宗玮等[16]研究结果不一致，可能与纳入患者数量及SLE病情有关，有待进一步研究。

　　抗dsDNA抗体是SLE的分类标准之一，2012年通过SLE国际临床协作组(SLICC)验证成为独立诊断SLE的血清免疫学指标，并作为监测疾病进展的重要指标[17]。AnuA是SLE诊断的标记性抗体，国内动物实验表明，核小体能刺激机体产生AnuA,并诱导抗dsDNA抗体与组蛋白抗体生成[18]。本研究结果显示，SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA水平升高，与王之青等[19]、邢红宇等[20]研究观点相似，分析机制在于，抗dsDNA抗体通过与肾小球系膜细胞结合，参与细胞核内成分反应，诱导细胞凋亡，损伤肾脏，诱发狼疮性肾炎，同时SLE患者机体免疫系统异常，导致核小体在体内异常堆积，继而刺激机体产生AnuA,从而引起肾组织损伤。进一步经Pearson相关性分析可知，抗dsDNA抗体、AnuA均与SLEDAI评分呈正相关，结合孙佳莹等[21]、麻贞贞等[22]研究推测机制在于，细胞死亡过程中会促使碎片结构释放，产生免疫逃逸，而抗原可刺激自身免疫淋巴细胞、浆细胞的分化，诱导自身抗体产生并形成免疫复合物，随血液循环在肾小球基底膜及系膜区大量沉积，进而刺激补体系统释放大量相关细胞因子，过度消耗补体，从而增加急性肾功能衰竭的发生风险，加重病情。因此，早期明确SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA水平，可为临床制订个性化诊疗方案、控制疾病活动度提供有效辅助手段。最后，本研究经ROC曲线还发现，抗dsDNA抗体、AnuA诊断SLE的特异度均为90.91%,与李和军等[23]采用免疫印迹法检测的研究结果具有一致性，有力佐证了ELISA应用于抗dsDNA抗体、AnuA检测与免疫印迹法具有相似的特异度，但ELISA更加简便，易于批量操作，获取客观结果。

　　另外，由于抗磷脂抗体临床表现缺乏特异性，故诊断依赖于ACA、抗β2GP1抗体等实验室检测。根据2006年抗磷脂综合征(APS)悉尼国际分类标准，IgG、IgM亚型的ACA、抗β2GP1抗体均为APS的诊断标志物[24]。本研究通过对比研究可知，与体检健康者比较，SLE患者IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平更高，这可能是由于SLE患者存在广泛血管病变，血管壁损伤会刺激凝血系统，增强纤溶酶原激活抑制物活性，改变血栓调节蛋白活性，抑制蛋白C活化，引发获得性抗活化蛋白C现象[25-26]。同时，本研究结果还表明，随着SLE疾病活动度加重，血清IgG-β2GP1、IgM-β2GP1、IgG-ACA、IgM-ACA水平出现升高趋势，这与廖永强等[27]观点相似，可能归因于SLE患者体内存在较强的补体活化，补体C3、C4水平显著降低，从而参与炎性反应，上调体内多种炎症因子表达，引发内皮损伤，加重凝血-纤溶系统紊乱，引起继发性APS,表现为反复形成动静脉血栓、红细胞功能异常等，加重组织与器官损伤[28]。进一步经ROC曲线分析可知，ACA、抗β2GP1抗体对SLE疾病活动度具有较高的评估价值。说明早期采用酶联抗体检测抗磷脂抗体水平，对评估SLE疾病活动度、预防脏器损伤具有指导意义。但其是否能作为反映SLE患者疾病严重程度及预后的生物标志物，今后仍需进行大样本量、多中心的研究。

　　综上所述，SLE患者血清抗dsDNA抗体、AnuA、抗Sm抗体及抗磷脂抗体水平明显升高，且抗dsDNA抗体、AnuA及抗磷脂抗体水平与SLEDAI评分呈正相关，早期采用酶联抗体检测上述自身抗体水平，对SLE的诊断、疾病活动度评估具有重要意义。

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