林木单倍体研究进展

摘    要：结合国内外文献，详细论述了林木单倍体的研究进展，对林木单倍体诱导的几种途径进行对比总结，分析了目前在林木单倍体育种中存在的问题并对这些问题提出了建议，并对其广阔的应用前景进行了展望，以期为林木单倍体诱导研究提供科学依据。

关键词:林木;单倍体;花药培养;花粉诱导;雌配子体;

Research progress of haploid in forest trees

ZHAO Zhenli ZHANG Shujing FAN Guoqiang

College of Forestry, Henan Agricultural University

Abstract：This paper discusses the research progress of haploid induction in forest trees in detail, compares and summarizes several ways of haploid induction in forest trees, analyzes the existing problems in haploid breeding in forest trees and puts forward suggestions on these problems, and prospects its broad application prospects, in order to provide scientific basis for the research of haploid induction in forest trees.

Keyword：forest trees; haploid; anther culture; pollen induction; male gametophyte;

高等植物减数分裂过程中产生雌配子和雄配子，雌、雄配子具有的染色体数目是体细胞的一半，这种仅由原生物体染色体组一半的染色体组数所构成的个体称为单倍体（Haploid）[1]。将单倍体培养与转基因相结合可使外源基因在转基因后代中迅速纯合，加快优良育种的选育进程；加倍单倍体群体在数量性状的遗传分析和分子连锁图谱构建等研究方面都具有重要作用。因此，单倍体育种具有可以缩短育种周期、提高育种效率等优越性，在遗传学、植物育种、生理学和胚胎学等领域研究中具有非常重要的价值[2,3,4]。然而，自然界中高等植物单倍体发生概率仅为0.001%~0.01%[5]，难以满足植物育种的需求，由此植物学家提出了应用人工干预的方法诱导产生单倍体的研究思路。植物人工诱导单倍体研究最早起始于20世纪，20世纪20年代 BUCHHOLZ等[6]首次在曼陀罗花（Datura stramonium）中发现自然产生的单倍体植株，在1964年印度学者 GUHA等[7]首次从毛蔓陀罗（Datura inoxia）花药培养中获得单倍体植株后，单倍体研究才陆续在不同科属植物中展开。林木作为植物中的重要组成，在生态环境保护和经济社会发展中发挥了重要作用，因此，植物育种学家们也非常重视林木单倍体的研究。但林木单倍体在自然界中基本为林木生殖期异常突变引起，其发生的频率相对于其他类型植物更低。因此，虽然单倍体育种技术已经广泛应用于禾谷、草本、果蔬等[8,9,10,11,12]作物的育种研究中，但由于林木单倍体研究起步较晚，成功获得单倍体的种较少，仅在椰子（Cocos nucifera）[13]和桑树（Morus alba）[14]等几个重要的林木植物中获得成功，严重影响了林木优良品种培育、林木物种进化、基因与性状关系等方面研究的进程。本文综述了林木单倍体的主要诱导技术以及在单倍体生产方面的研究进展，分析了目前中国在林木单倍体诱导存在的问题并对其发展前景进行了展望，以期为林木单倍体研究提供参考。

1 单倍体主要诱导技术

林木单倍体的诱导主要有体外诱导和体内诱导两种方法。体外诱导法主要包括雄配子体诱导和雌配子体诱导，体内诱导法主要包括远缘杂交诱导和花粉诱导[15]。

1.1 体外诱导单倍体技术

1.1.1 雄配子体诱导单倍体

雄配子体诱导的发育途径主要有胚胎发生和器官发生两种，具体操作为将植物的花药或花粉分离出来去培养成单倍体个体[16]。花药培养和花粉培养是目前人工雄配子体诱导林木孤雄生殖产生单倍体的两个主要途径[17]。目前很多植株均已成功经雄配子体诱导获得了单倍体植株[18]。

1.1.1.1 花药培养诱导单倍体

花药培养诱导单倍体具体措施是将花药接种在人工配置的诱导培养基上，使其进一步发育形成组织，直至生长分化为完整单倍体植株[19]。由于花药培养操作相对简单高效，所以在林木单倍体诱导研究中应用较多。MAHESHIWARI等[7]在20世纪60年代通过花药培养首次从曼陀罗中获得了完整单倍体个体，为林木单倍体研究提供了研究基础。此后，大麦（Hordeum vulgare）、烟草（Nicotiana tabacum）、石刁柏（Asparagus officinalis）等各类植物通过花粉培养成功获得单倍体[20]。林木上通过花粉培养诱导单倍体的研究自20世纪60年代首次获得成功后进入快速发展阶段，目前关于林木花药培养的单倍体诱导研究报道的有欧洲七叶树（Aesculus chinensis）[21]、辽杨（Populus maximowiczii）[22]、阔荚合欢（Albizia lebbeck）[23]、双翼豆（Peltophorum pterocarpum）[24]、印楝（Azadirachta Indica）[25]、茶树（Camellia sinensis）[26]、橡胶树（Hevea brasiliensis）[27]、苹果（Malus pumila）[28]、枣（Ziziphus jujuba）[29]、豫杂泡桐（Paulownia tomentosa × Paulownia fortunei）[30]等。然而，由于林木的生殖周期普遍较长，并且对物种和基因型有很强的依赖性[31,32]，影响了花粉培养诱导单倍体技术的进一步发展。

1.1.1.2 花粉培养诱导单倍体

花粉培养诱导单倍体是选择单个花粉来进行体外培养的一种单倍体诱导技术，单倍体植株由雄核发育而来。花粉培养的优点体现在花粉密度高，每毫升培养基就可培养出近千个胚胎，还可有效避免体细胞产生的干扰[33]。20世纪60年代末到80年代初是花药培养诱导单倍体的快速发展时期，至20世纪80年代就有两百多种植物获得单倍体植株，其中包括苹果、桃（Prunus persica）、楸子（Malus prunifolia）、茶树、橡胶树等多类林木树种[18]。中国最早通过花粉培养成功获得单倍体的林木树种是黑杨（Populus nigra）[34]，之后在橡胶树[35]、苹果[36]、荔枝（Litchi chinensis）[37]、锦丰梨（Pyrus bretschneideri）[38]、金丝小枣（Ziziphus jujuba）[39]等30多类林木树种中也成功诱导出单倍体植株。但在大量研究结果中也发现，目前，育种材料基因型和技术体系成熟度仍是花粉培养的最大限制条件[40]，并且花粉诱导的启动机制和诱导机制目前尚不明确，因此，揭示花粉培养诱导单倍体的分子机制将会提高该项技术应用的广度和深度。

1.1.2 雌配子体诱导单倍体

雌配子体诱导主要是将植物未受精的子房或胚珠进行分离培养，使其单性发育形成完整植物体。雌配子体诱导中虽然卵细胞、助细胞和反足细胞均具有发育为完整个体的潜力，但目前应用最多的主要是培养具有8个细胞核的胚囊来获得单倍体，同时为了提高单倍体诱导成功率，常将胚囊和胚珠同时进行离体培养[41,42,43]。1964年TULECKE[44]最早从裸子植物银杏未受精的子房得到单倍体愈伤组织，在此基础上SAN等[45]于1976年成功培养出了大麦的单倍体植株。但林木方面通过雌配子体技术仅在杨树（Populus）[46]、三叶橡胶树（Hevea brasiliensis）[47]、刺槐（Robinia pseudoacacia）[48]等少数树种上获得了成功。研究中发现雌配子体诱导的单倍体具有遗传稳定、白化苗率低等优点[49]，同时也显示其诱导效率极低，但是在有孤雄生殖障碍、无法进行花药或花粉培养、雄配子体诱导基因突变或死亡的植株中，雌配子体诱导是唯一且有效的途径[50,51,52]。

1.2 体内诱导单倍体技术

1.2.1 远缘杂交诱导单倍体

远缘杂交诱导是通过生理遗传限制使个体的染色体发生选择性消除而最终得到单倍体植株，分为属间杂交和种间杂交两种诱导方式。植物中常是将远缘物种相互进行授粉，在杂交后代中筛选出染色体偏向性消除的个体，并继续进行种间杂交，从而获得染色体消除的单倍体植株，这种连续杂交方式叫做染色体消除型杂交或核型不稳定的杂交。植物种间杂交诱导已经在一些农作物上广泛开发应用[53]，在银白杨（Populus alba）和白榆（Ulmus pumila）等林木方面有利用单倍体诱导种间杂交的相关研究报道[54]，龚洵等[55]研究发现木兰科（Magnoliaceae）植物的不同属之间杂交亲合力强，因此其产生的后代杂交性较强，上述研究结果均可为林木单倍体的诱导研究提供借鉴。

1.2.2 花粉诱导单倍体

花粉诱导是在植株授粉前通过物理或化学处理的方式来获得单倍体的方法。物理处理在研究中主要是辐射诱导，即将经过辐射而丧失活力的花粉授于花朵柱头上，使得卵细胞不能正常受精而只发生细胞分裂，再经培养而获得单倍体植株。化学处理主要是将二甲基亚砜、激动素、秋水仙素、甲苯胺蓝等化学药剂喷洒到未授粉的雌体上使其后续发育为单倍体植株[41]。林木利用花粉诱导单倍体多采用辐射诱导，目前利用该方法成功获得单倍体植株的研究报道较少，获得成功的主要集中在杨柳科（Salicaceae）杨属中的黑杨等少数树种[56,57]，何道一等[58]通过辐射诱导成功诱导出苹果单倍体植株，岳华峰等[59]在木瓜（Chaenomeles sinensis）的花粉中也取得了成功。此外，科研工作者也采用延迟授粉时间的方法，延迟授粉可导致植株花粉中遗传物质受损，致使后续植株发育形成单倍体，但延迟花粉授粉的时间需要根据不同物种的开花节律去灵活掌握，因此在实际研究中通过延迟授粉方法获得单倍体这种诱导方法在实际研究中应用较少。

2 林木单倍体的应用

2.1 纯合子二倍体

单倍体是不育的，因此需要加倍染色体才能产生可育植株，称为双单倍体或纯合子二倍体（DH）。DH技术由于其便宜和高效在作物新品种选育和遗传研究中具有独特的优势，使育种进程更加快速有效[60]。研究发现，在多年生乔木中，用常规方法获得纯合子二倍体植株是很困难的，但是运用DH技术却能在2代内获得完全纯合的新品种。随着单倍体技术和染色体加倍技术的发展，DH越来越多的应用于植物的遗传育种和基因改良中[61]，其中林木方面已经在榆树（Ulmus pumila）[62]、杨树（Populus）[46]、油松（Pinus tabuliformis）和樟子松（Pinus sylvestris）[63]等树种育种中取得了成功。

2.2 基因工程

近年来，单倍体诱导与遗传转化相结合的技术措施在生物学研究中应用越来越广泛。科研工作者通过对受体转基因植株进行诱导，使其产生单倍体并进行加倍和分子检测，筛选到含有目的基因的纯合转基因植株，通过这种方法不仅可以缩短传统育种年限、定位目标基因和鉴定基因功能，还可将植物筛选出的标记基因敲除，获得相应的转基因植株[64]，同时还可结合基因编辑技术在植株1世代获得优良的DH新品种，并在此基础上深入开展基因修饰等相关技术的研究正逐步应用于林木个体优良品质的提升和利用方面[65,66]。近年来，CRISPR基因编辑等分子生物学技术的兴起和发展也为林木单倍体诱导指明了新的研究方向。研究者们普遍认为下一步林木育种的研究应该着重于单倍体诱导效率和相关基因挖掘等方面，为后续生产应用奠定理论基础。

2.3 基因功能研究

由于林木的杂合子特性，其某一亲本的优良性状是否能出现在后代中不确定，只有在不同的纯合子二倍体植株之间进行杂交时才能明确各种性状的显性基因[67,68]，林木的这种特性致使许多重要经济性状的遗传机制尚未得到清楚的阐明，严重影响了林木遗传研究的进展。DH群体是基因组学研究的重要对象，也是遗传连锁图谱构建和QTL定位等方面的理想研究群体。通过DH群体可使候选基因的靶向性更加准确[69]，从而为研究基因定位和功能基因的发掘奠定基础，并为育种提供新的思路和途径。随着科学研究的不断发展，单倍体植株的优良特性在转基因等研究领域将发挥更重要的作用，使得林木单倍体的研究价值和意义在相关领域中愈加突出。

2.4 诱导突变

诱导突变是将基因和表型直接联系起来的一种处理手段，植物的诱导突变大部分是隐性的，且由于存在显性等位基因从而在杂合子二倍体细胞中多不表达，而单倍体植株因只具有一组染色体，其显隐性性状可以在不同的植株中同时表现。在基因组水平上，单倍体本身可以被认为是突变体，其与DH技术相结合可以做到快速分离和纯合突变体后代。此外，诱变处理的原始材料多为植物的种子，但随着科技的发展如今多选择处理植株的目的小孢子，诱变处理后的配子细胞形成胚胎，选育后形成DH系，之后可高效地应用于构建纯合突变体新品种[70]。近年来，林木树种的研究中单倍体诱变技术结合 DH 技术已成为一种具有广阔应用前景的遗传育种研究方法。

3林木单倍体诱导存在的问题及展望

3.1 林木单倍体诱导效率较低

目前，基于单倍体诱导技术的林木遗传改良普遍在杨树、刺槐和橡胶树等树种中开展并获得了较好的研究成果，报道也指出有些林木单倍体诱导率达到30%以上，但诱导时受体植株易产生异常突变，严重时甚至直接使受体死亡，从而导致真正获得林木单倍体的诱导效率偏低，所以后续应用中需要考虑诱导系的遗传背景，将品系优良、性状稳定且诱导潜力高的品系杂交，从而选育出高效优良的林木单倍体[71,72]。

3.2 林木单倍体诱导易受基因型影响

林木单倍体诱导中应用较多的是花药培养和花粉培养技术，在花药培养中面临的最大问题就是基因型特异性，尤其是林木树种花粉间基因型多有不同，且花粉的发育能力易受培养环境影响，因此需要选取最适宜的培养基和培养条件来提高花药培养获得单倍体植株的效率。相比之下花粉培养诱导单倍体具有诱导数量多且受基因型特异性影响小等优势，但花粉培养过程中也需要优化培养程序和预处理条件等因素，以进一步提高花粉培养产生单倍体的效率[15]。因此，通过基因工程技术降低花粉培养对基因型依赖性而提高花粉培养诱导单倍体的效率将是有效的培育途径。

3.3林木单倍体诱导其他限制因素

在诱导产生单倍体的过程中，还存在内源性和外源性等限制因素，主要有亲本基因型、亲本生理状态、初始配子体细胞发育阶段、配子体细胞的物理处理、不同添加剂和植物生长调节剂等[73]。研究发现，花药壁是影响花粉胚发育的重要因素[74]，PELLETIER等[75]在1972年提出了“壁因子”这一学说，认为防止花药壁组织愈伤组织过度增殖是获得高产量的花粉胚状体和花粉愈伤组织的重要因素。在林木树种的花药培养中，不同时期的花粉愈伤组织、胚状体和花药壁组织的体细胞愈伤组织可能会同时发育生长，而分离小孢子培养则可有效避免花药体细胞组织愈伤组织的形成[76]，但这种措施在林木上应用还存在一定困难。

3.4 前景展望

植物单倍体诱导研究越来越受到科研工作者的重视，随着生物技术的发展以及人们对多倍体和单倍体的深入研究，植物倍性育种具有广阔的前景，目前已有两百多种植物获得了单倍体植株，其中林木单倍体诱导研究也取得了一定成果，但与其他植物种类相比，林木单倍体诱导研究进展缓慢。由于林木物种具有生长周期长、杂合度高和繁殖生物学复杂等特点，尤其是基因型的特异性导致一些重要林木物种至今未能获得单倍体植株。具体研究过程中，单倍体植株常通过秋水仙碱、氨磺乐灵、氟乐灵和甲基胺草磷等化学试剂处理来获得二倍体植株。其中，秋水仙素利用最为广泛，但秋水仙素具有用量大、毒性高、价格高等特点，易危害人类健康和生态环境，因此需要寻找价格优惠的环境友好型化学药剂。近年来，林木花药培养技术取得了快速发展，但有关花药培养的启动机制、发育途径、诱导机理以及与遗传因素、生理生化之间的关系还不明确，利用单倍体器官和组织进行遗传转化的研究也不够深入。揭示单倍体诱导及胚胎形成的分子遗传机制以及清晰认识单倍体基因组自然加倍的遗传机理等都是提高花药培养诱导成功率的关键，进一步利用林木树种的自然加倍遗传机制结合人工诱导单倍体将会是林木遗传育种方面具有广阔前景的一个研究方向。

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