血小板浓缩物在创面愈合中的研究进展

摘    要：血小板浓缩物包含富血小板血浆(PRP)、富血小板纤维蛋白(PRF)及浓缩生长因子(CGF),作为创面愈合领域的新疗法被广泛应用。本文通过对PRP、PRF、CGF的制备方法、三维结构、生理机制进行对比分析,阐述了各代血小板浓缩物的特性及区别,并且在基础研究及临床进展方面做了进一步归纳总结。最后提出了血小板浓缩物在创面愈合中的不足与展望。

关键词:血小板;富血小板血浆;富血小板纤维蛋白;浓缩生长因子;创面愈合;

皮肤伤口的正常愈合需要许多复杂的生物和分子事件的协调,包含着炎症、组织形成和组织重塑阶段。皮肤创面分为急性创面和慢性创面。慢性创面主要是由于自然愈合过程的中断,包括外伤、静脉溃疡、压疮、糖尿病足溃疡等。在某些情况下自然愈合过程被抑制,还可能导致慢性难愈创面的形成[1]。慢性创面导致患者的生活质量下降以及形成巨大的社会负担。虽然清创和换药治疗是目前慢性创面的常用措施,但往往达不到令人满意的结果,所以急需新的治疗方法。而随着专家们对组织修复技术的了解加深,发现生长因子是一种重要的修复治疗策略,其在各种细胞与细胞外基质之间传递着关键信号,加速了内源性修复机制的启动。在包含生长因子的各种治疗方式中,富血小板血浆(PRP)在修复创面方面具有极大的优势,PRP包含了自体细胞、白细胞、血小板衍生的生长因子和纤维蛋白支架,可以构建出模拟组织再生和愈合的生物微环境。在急、慢性创面及复杂感染创面中,PRP通过改善炎症、以特定的模式能够提供多种生长因子及细胞、加快了细胞的募集和增殖,诱导刺激受损创面进行再生。之后改进的两种血小板浓缩物——富血小板纤维蛋白(PRF)和浓缩生长因子(CGF)通过改良制作方式在创面修复方面表现出了更多优异特性[2]。相较于清创、换药等传统创面治疗方式,血小板浓缩物具有更显著的改变局部微环境和加速组织再生的能力。此外,由于血小板浓缩物可以由自身血液采集,制作简便、经济,且有安全性,在临床工作中容易推广。

1 血小板浓缩物的制备

目前血小板浓缩物是通过离心得到的,且具有多种不同制作的方法。有一次离心法、二次离心法以及多次离心法。二次离心法被PRP采用得较多,制备方法主要参照Landesberg法[3]。不同的离心次数、离心时间和离心力的条件下产生的血小板浓缩物会存在一定的差异。PRP是在全血中加入抗凝因子,然后根据全血中不同成分密度的不同以梯度离心分离,从而分离出成品PRP;PRF的制作标准是将血液样品收集在未加入抗凝剂的10 mL的玻璃离心试管中,以3 000 r/min离心10 min,最新研究显示离心角度的不同也会对PRF的最终性质有重大影响[4];CGF的制作需要特殊的离心机进行变速离心,制备中也无需添加任何外源性物质,仅是采用离心机中特定的离心程序制成[5]。

2 血小板浓缩物的三维结构

不同的制备方式使得血小板浓缩物的三维结构存在差异。PRP的结构为四分子或双侧纤维蛋白分支连接。在PRP中凝血酶浓度在双侧连接处浓度会很高,使得PRP更浓稠以及形成刚性网络,而刚性网络不利于细胞因子融合和细胞迁移[6];PRF的结构为三分子或等边纤维蛋白分支连接。与PRP相比,因为PRF中凝血酶浓度低,所以可以有非常高比例的等边连接。以这种连接方式所构成的纤维蛋白网络比较精细,能够允许细胞因子融合和细胞迁移。除此之外,因为PRF特殊的三维结构还使得其具有较好的柔韧性和弹性[6];CGF的结构与PRF类似,原因是制备方式比较相近,但是在扫描电镜下观察到CGF的纤维蛋白比PRF的更厚、更规则[7]。其纤维蛋白分子直径约0.5 μm,纤维间孔隙直径约4.5 μm。这也可以解释CGF比PRF的拉伸强度和生长因子含量都要高的结果[8]。

3 血小板浓缩物促进创面愈合的生理机制

3.1 各成分浓度及影响

血小板浓缩物主要包含CD34+细胞、纤维蛋白、白细胞、血小板、抗炎因子以及多种生长因子。而生长因子包括血小板生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子(IGF)-1[9]。有研究比较了PRP、A-PRF与CGF的各种成分浓度,发现在血小板浓度、白细胞浓度、TGF-β1浓度及VEGF浓度方面,PRF的浓度是最高的,浓度顺序依次为A-PRF>CGF>PRP。在PDGF-BB、EGF浓度和bFGF方面,CGF的浓度比例是最高的;在白细胞介素(IL)-1β浓度方面,PRP的浓度是最高的。而在成骨细胞数量方面,CGF显著大于PRF[8,10]。与生长因子浓度高低表现出的确切效果不同,不同浓度的白细胞对于血小板浓缩物促进创面的影响是存在争议的。目前部分研究者在实验中证明高浓度的白细胞是有利于创面愈合的。Devereaux等[11]的研究中发现高浓度的白细胞和血小板对成纤维细胞表现出一种持续刺激合成代谢的促进作用,高浓度白细胞的富血小板血浆(LR-PRP)相较于低浓度白细胞可以更好地促进伤口愈合。而在Feng等[4]的实验中也是类似,更高白细胞含量的PRF 表现出比低白细胞含量更好的抗菌及愈合效果。

3.2 外泌体与纤维蛋白基质的影响

近年来的研究证明外泌体和纤维蛋白基质是PRP促进伤口愈合的重要效应物。Guo等[12]在糖尿病大鼠模型中构建了全层皮肤缺损的伤口,来研究PRP外泌体促进愈合的能力。结果表示,在伤口闭合的所有时间点,PRP外泌体组伤口闭合的速度明显快于PRP组。在血管密度、胶原重塑和上皮再生等方面,外泌体组的作用更强。且经过外泌体处理的缺损处与 PRP或未处理组相比,具有更多类似于毛囊和皮脂腺的结构。此外,研究组还表明ERK和AKT信号通路在PRP中与创面愈合相关联,并且PRP 诱导的再上皮化可能由YAP的激活触发。除外泌体之外,纤维蛋白基质也在促进愈合中扮演着重要角色。与PRP相比较,后两代血小板浓缩物PRF和CGF均有3D纤维蛋白结构,特殊的空间结构使得它们能延缓生长因子的释放,有更强的细胞募集和增殖能力[13]。通过鸡绒毛尿囊膜试验发现,同样在有大量生长因子的情况下,有纤维蛋白基质存在的组别会有更强的血管生成能力[14]。Roy等[15]也有类似的发现,他们首先在体外培养基中证明了富含血小板的纤维蛋白基质(PRFM)逐渐缓慢释放PDGF-BB、TGFβ1 和 VEGF-A生长因子。并且根据人类微血管内皮细胞的加速增殖,证明了释放的生长因子的活性。此外,该研究团队还在猪背部制作了缺血性伤口模型,来确定PRFM对伤口愈合的影响。相较于未用PRFM治疗的对照组,PRFM治疗组增殖细胞数量变多,生成了更多的血管。与Guo等[12]的实验结果相似,Roy等[15]表明PRFM释放的VEGF主要是通过ERK激活途径与内皮有丝分裂反应相联系。

4 血小板浓缩物在创面中的应用

4.1 PRP

在急性创面的表现上,最近一项449例患者的随机对照研究(RCT)荟萃分析中显示,与传统辅料相比,PRP辅助治疗烧伤患者的伤口闭合率(P<0.05)和愈合时间(P<0.05)均有更好的表现[16]。不足的是,该研究只纳入了8项RCT,个别研究中的样本量也较低,还需大规模的RCT论证有效性。在一项包含骨折、闭合性皮肤损伤、烧伤的随机对照试验(RCT)中,PRP凝胶治疗后,创面愈合速度明显加快[17]。在减轻疼痛、提高预后质量方面,一项PRP联合激光治疗痤疮瘢痕的荟萃分析中表明,PRP联合治疗后,结痂、红斑和水肿持续时间均有显著缩短,患者满意度也明显高于单独的激光治疗[18]。而在手术切口创面方面,一项研究藏毛窦疾病患者术后恢复的RCT表明,PRP辅助治疗的患者疼痛得到了明显缓解,切口创面闭合的恢复时间也显著缩短[19]。以上结果提示,应用PRP对急性创面的治疗和预后的改善极具价值。

在慢性创面的表现上,Qu等[20]的荟萃分析中表明,与不使用 PRP 的治疗相比,PRP 治疗显著增加了下肢糖尿病溃疡的完全伤口闭合,缩短了完全伤口闭合的时间,以及减少伤口面积和深度。在伤口感染、截肢、伤口复发或住院方面没有发现明显变化。一项前瞻性RCT比较了PRP和生理血清在Ⅱ期压疮上的治疗效果。研究结果发现压疮面积、渗出液、组织类型的平均评分改善(P<0.05)。这表明用 PRP 凝胶敷料可在短时间内治愈Ⅱ期压疮。与前几年的相似研究进行对比,结论也是一致的。不仅如此,PRP组的治疗费用也远低于对照组[21]。皮片移植是慢性创面治疗的重要方式之一。有研究者进行了PRP辅助皮片移植的荟萃分析,结果表示PRP的使用使移植物丢失的概率降低了85%,血肿形成的概率降低了79%[22]。此外有两项下肢静脉性溃疡的前瞻性RCT还比较了PRP不同的使用方式对治疗的影响。从溃疡完全治愈率、不同时间段溃疡的减少面积、不良反应和复发事件等指标显示,PRP干预的组别要明显好于常规的压迫治疗,其中PRP局部注射的效果要好于外敷治疗[23,24]。综上所述,PRP治疗慢性创面效果显著,安全性好,性价比高。

4.2 PRF

在急性创面上,由于PRF的纤维蛋白纤维很粗,构成了致密的缓慢降解材料[25],支持其能够缓慢释放细胞因子及发挥更强的抗炎作用。目前还开发出了可注射的PRF(I-PRF),可以在深层创面也形成缓慢降解的纤维蛋白基质[26]。Schulz等[27]对面部、手部烧伤至深度的患者使用酶清创后,使用液体PRF喷洒至创面表面形成了稳定的纤维蛋白基质。患者治疗后烧伤部位的愈合时间及瘢痕均有改善。与传统的清创、换药方式相比,PRF的喷洒方式更容易覆盖于耳部和手指缝隙等不平坦创面。一项三盲的随机对照临床试验比较了PRF凝胶与凡士林纱布在供皮区创面的治疗影响。与凡士林纱布相比,PRF凝胶组的创面愈合时间、愈合率和疼痛程度均有明显的改善(P<0.05)。结果提示PRF凝胶相较于传统方式更有利于供皮区的治疗[28]。而在术后切口方面,一项全喉切除术后的RCT将PRF应用于切口创面以防止咽皮肤瘘。与传统治疗对照组相比,PRF治疗组术后除了伤口愈合加快,创面疼痛和水肿程度也有显著减轻[29]。因此,在急性创面上,从PRF更广泛的使用方式、更好的愈合结局和预后质量来看,与传统治疗相比PRF优势巨大。

在慢性创面上,在一项RCT荟萃分析中比较了PRF敷料与标准伤口护理在慢性难愈皮肤溃疡(主要为静脉性溃疡和糖尿病足溃疡)的疗效。结果为PRF治疗组完全愈合的溃疡数量、溃疡面积减少优于标准伤口护理,且完全愈合的溃疡数量差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与标准伤口护理相比发生并发症的概率没有区别[30]。该研究提示PRF治疗慢性难愈皮肤溃疡疗效好,且安全性佳。除了难愈性溃疡创面外,PRF还多用于瘘管、窦道的治疗。在欧洲的一项前瞻性多中心研究使用了PRF封闭治疗复杂肛周瘘。具体操作为在刮除瘘道去除肉芽组织后,使用浸润过氧化氢的纱布清洗,以PRF密封瘘管。该研究中复杂瘘患者的治疗成功率超过65%(目前尚未有方案超过80%的成功率),且并发症出现的百分比为3.33%,远低于其他方案接近30%的发生率[31]。另一项研究使用PRF注射治疗继发于药物相关颌骨坏死的面部皮肤窦道。该研究治疗后瘘管和骨病变愈合,症状改善明显,且患者的满意度高[32]。此外,一项RCT比较了PRF与PRP在治疗慢性难愈性腿部溃疡中的疗效。结果表明PRF组平均溃疡愈合时间为5.7周,PRP组为6.5周。溃疡愈合率方面PRF组为73.3%,PRP组为53.3%。结果表明,在治疗慢性溃疡方面,PRF比PRP的效果更好[33]。还有类似研究表明,对于不适合标准皮肤移植或皮瓣移植的伤口的肌腱暴露区域,使用纤维蛋白结构致密、降解缓慢的PRF可能是更好的选择[34]。以上研究结果表明了PRF治疗慢性创面相较于标准伤口护理或传统方案有着显著优势,且能大幅降低部分疾病的并发症。

4.3 CGF

在急性创面上,CGF的生长因子也能长时间持续释放,但是CGF比PRF含有更多的生长因子,CGF的血管内皮生长因子达到了PRF的1.5倍[35],在纤维蛋白含量方面,CGF也较PRF更高[36],CGF在治疗中可以有效增强和改善组织再生[37]。汪淼等[38]在浅Ⅱ度伴部分深Ⅱ度烧伤创面上行液态CGF注射及凝胶态CGF覆盖治疗。结果表明相较与清创、抗感染、活血化瘀、换药等常规处理,CGF治疗可以促进创面愈合,加快创面愈合速度,提高创面愈合质量,控制感染,减轻瘢痕形成。总体而言CGF治疗烧伤创面具有很好的前景。一项RCT将自体浓缩生长因子膜应用于因手术致口腔黏膜组织缺损的修复。CGF组的创面愈合率、VAS及VSS评分均优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示应用CGF膜修复口腔黏膜组织缺损安全有效,还可减轻术后不适感[39]。吴元元等[40]还研究了CGF对前臂皮瓣供区术后感觉功能恢复的影响。术中将CGF覆盖于暴露的桡神经上,术后冷热感觉、机械感觉和痛觉均有显著差异(P<0.05)。结果表明CGF可促进皮瓣供区术后感觉恢复。该研究结果提示CGF用于皮瓣供区创面的恢复是一个有价值的方向。

在慢性创面上,Kao[41]在16例糖尿病足、静脉性溃疡和压疮等慢性创面患者中进行了CGF的治疗试验。发现CGF凝胶可以加速伤口处软组织的再生,而CGF膜可促进其边缘再上皮化。两者结合可有效、安全地促进深、浅表创面的自体再生。在体外实验也观察到CGF上的HaCaT细胞迁移和增殖形成上皮样结构。结论表明CGF可以促进软组织再生和创面边缘再上皮化。在另一项多中心的RCT中,比较了CGF与标准伤口治疗100例患有下肢慢性混合性溃疡的疗效。CGF组在12周内的伤口完全愈合比例为(53/53),而标准治疗患者中比例仅为(32/47)。而且在CGF组中均未观察到GCF的并发症或不良反应。该研究表明在慢性混合性溃疡的治疗中,CGF是有效的,且每次的疗效持续时间更长,可以使溃疡愈合更快、疼痛更小。虽然CGF单次治疗费用会更高,但是整体而言愈合时间缩短反而导致总费用降低[42]。Park等[7]还将PRF、CGF和合成骨移植到成年犬的股骨缺损处来研究治疗效果。试验表明CGF的成骨效果比PRF好。该研究提示如果将CGF应用于临床时,可能比PRF表现出更好的效果。因此,从已有的动物和临床案例来看,CGF在创面愈合领域具有极高的价值。

5 展望

近来随着研究的进一步深入,血小板浓缩物还有了一些新的发现。例如,PRP浓度为1.0×106 plt/μL似乎能发挥最佳的效果[43]。与传统治疗方式比较疗效时,随访时间为4～8周可能是最合适的选择[30]。在联合材料的特性上也得到了一些结论,海藻酸盐和水凝胶亲和力最高,不会干扰细胞功能,但对释放物的保留程度适中;相反,泡沫隔离了释放物并阻碍了生长因子的释放,从而损害了细胞活动;此外,薄膜和网片的释放保持力非常差,与PRF本身无区别[44]。国内外研究者正尝试将血小板浓缩物联合不同生物相容性的支架材料,如羧甲基纤维素支架、丝素蛋白和复合壳聚糖敷料等,应用在如感染创面、全层皮肤缺损创面、骨缺损创面等复杂创面,具有良好前景。还有研究证明,冷却液体PRF后能够将液体PRF的工作特性延长90 min以上,这提示了冷却或者冻干等降温保存方式可能是一种改善血小板浓缩物储存的策略[45]。国内协和医学院的课题组[46]也有类似研究,他们将具有调控生长因子释放的丝素蛋白与PRP-壳聚糖伤口敷料相结合,解决了壳聚糖敷料贴合度低以及PRP在壳聚糖中生长因子释放过快的缺陷,同时又加强了吸湿和止血效果。该研究将PRP-壳聚糖溶液中加入1∶1、1∶3、3∶1、1∶0体积比例的丝蛋白溶液,最后进行冻干。然后与纯壳聚糖敷料组作对照,以此研究PRP和丝素蛋白对止血性能以及PRP生长因子释放的影响。在PRP-壳聚糖溶液与丝素蛋白体积为1∶1配比时,敷料达到最致密的微观孔隙结构与极高的吸水性,在体外凝血与大鼠止血实验中证明此敷料止血性更好。与此同时,在检验生长因子的控制能力时,可观察到明显调控了PDGF-BB,证明在控制生长因子释放方面此敷料也具有很高的潜力。上述研究提示,将不同特性的材料与血小板浓缩物结合能有望提高其在不同创面领域的治疗效果,是未来具有潜力的研究方向。

血小板浓缩物作为一种新型生物治疗方式,在急、慢性创面的多种临床环境中均有应用,除了促进创面愈合和组织再生的修复作用以外,还能降低治疗过程中的疼痛与感染,具有极高的治疗潜力。然而血小板浓缩物在未来还有一些方面亟待突破:进一步明确血小板浓缩物的规范制作标准、应用方式、禁忌证和适应证;进一步验证血小板浓缩物中各成分比例以及与创面愈合的分子机制;进一步发掘合适的联合材料并促进更广泛的临床应用。此外,血小板浓缩物每次所制备的量是有限的,不利于大面积创面的应用,研究如何短时间大量制备以及长时间储存也是未来发展的路线。

利益相关声明:所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明:吴锦涛参与论文撰写,采集文献及数据,分析文献及数据;邹立津参与对论文的内容作批评性审阅及指导;刘兆辉参与采集文献及数据;何霞飞参与采集文献及数据。

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